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壹、膽固醇測定的方法包括：直接皂化比色法、氧化酶法、氣相色譜法、高效液相色譜法。本實驗使用的是直接皂化比色法。 1.直接皂化比色法：當固醇類化合物與酸作用時，可脫水並發生聚合反應，產生顏色物質。因此可先對食品樣品進行皂化和提取，用硫磷鐵試劑作為顯色劑，測定食品中膽固醇的含量。步驟：①抽提；②皂化；③毛地黃皂苷沈澱純化；④顯色比色四個階段。 2.氧化酶法：血清中的膽固醇酯(CE)被膽固醇酯水解酶(CEH)水解成遊離膽固醇(Chol)，後者被膽固醇氧化酶(CHOD)氧化成△4—膽甾烯酮，並產生過氧化氫，再經過氧化物酶(POD)催化4—氨基安替比林與酚(三者合稱PAP)，生成紅色醌亞胺色素(Trinder反應)。醌亞胺的最大吸收在500nm左右，吸光度與標本中總膽固醇呈正比。步驟：在樣品的冰乙酸提取液中加磷硫鐵試劑，膽固醇與試劑反應產生紫紅色化合物，顏色的深淺與膽固醇的量成正比，可用分光光度計在波長560nm?處測定。 ?3.氣相色譜法：取樣時，由於氣相色譜儀進樣少，應嚴格控制樣品質量。由於內標物5-α-膽甾烷不被皂化，可先加入與樣品混勻。利用皂化反應RCOOR′+NaOH→RCOONa+ROH的原理，使樣品中的主要成分油脂通過遇苛性堿水解成用來制造肥皂脂肪酸鈉或鉀和甘油，而非皂化物膽固醇和內標物仍穩定存在。利用皂化的水解產物（脂肪酸鈉或鉀和甘油）易溶於水而膽固醇和內標物不溶於水的特點進行萃取，得到溶有膽固醇和內標物的石油醚溶液。棄去的的水相經兩次石油醚提取後基本回收殘留在水相中的膽固醇和內標物。得到的石油醚溶液進行吹幹後可取1μL進行氣相色譜法檢測。 4.高效液相色譜法：提要樣品中膽甾醇用適當有機溶劑提取，得到膽甾醇和脂類物質的混合物，經皂化後除去脂類幹擾物，再用適當的有機溶劑提取膽甾醇，以高效液相色譜儀測定 。 二、實驗中樣品皂化的作用是： 利用皂化反應RCOOR′+NaOH→RCOONa+ROH的原理，使樣品中的主要成分油脂通過遇苛性堿水解成用來制造肥皂脂肪酸鈉或鉀和甘油，而非皂化物膽固醇和內標物仍穩定存在。利用皂化的水解產物（脂肪酸鈉或鉀和甘油）易溶於水而膽固醇和內標物不溶於水的特點進行萃取，從而去除其他脂類幹擾物，減少幹擾，提高測試精度。