聖安德烈亞·瓦勒教堂
在警察總督史卡比亞的主題旋律下，揭開序幕。衣衫襤褸、面容憔悴的越獄政治犯安傑洛提逃到教堂裏，他的妹妹已經安排好壹把鑰匙，讓安傑洛提可以暫時躲進教堂內的小禮拜堂，避避風險。這時，壹位教堂司事走了進來，他不停抱怨工作太繁重，直到畫家卡伐拉多西進來之後，他才停止繼續發牢騷。卡伐拉多西在教堂壹側搭了壹個畫臺，畫架上是壹幅尚未完成的仕女圖；卡伐拉多西看著畫像中金發碧眼的女士，忍不住發出贊嘆，但心裏面卻想著自己的愛人托斯卡：“在各種美的事物中，有壹種奇妙的調和。我親愛的托斯卡有壹頭烏黑亮麗的頭發、還有壹對閃亮的黑眼，而畫裏面這位不知名的女士卻是金發碧眼。我雖身在畫前，心裏所思所想都只有托斯卡！”(詠嘆調：奇妙的和諧)。
在教堂執事離開後，卡伐拉多西正要提筆做畫，卻聽到身後有聲響，回頭壹看，從小禮拜堂走出壹位步履蹣跚、狼狽不堪的男子，卡伐拉多西仔細打量對方之後，才認出眼前這位竟然是他的好友、也就是前羅馬***和國的領事安傑洛提。適巧托斯卡前來教堂尋找卡伐拉多西，見大門反鎖，於是在門外大聲呼喊，卡伐拉多西見狀趕緊教安傑洛提再躲進小禮拜堂內，因為他不想讓托斯卡知道太多事(托斯卡人雖善良，但有時就是嫉妒和猜疑心重，而且還守不住秘密)。在打點好安傑洛提之後，卡伐拉多西才前去應門；托斯卡怒氣沖沖地走進來，並質問卡伐拉多西是不是在跟其它的女人幽會？在卡伐拉多西好言相勸之下，托斯卡才稍微釋懷，並邀約卡伐拉多西***度良宵。卡伐拉多西以手邊尚有工作為由，暫請托斯卡離去，而托斯卡離開前，卻瞄見卡伐拉多西正在趕工的畫作，上面竟是壹位金發藍眼的美女，於是又大發醋勁。卡伐拉多西安慰著說，這世上還有哪對眼珠可以和托斯卡的黑眸相比呢？但托斯卡還是不放心地再三交待，要卡伐拉多西把畫上女子的眼珠改為黑色，才行離去。
托斯卡走後，卡伐拉多西暗示安傑洛提走出小禮拜堂，準備帶他到鄉間別墅避風頭。之後，教堂司事和教士以及唱詩班團員壹擁而進，他們正為原本要入侵意大利的拿破侖法軍被擊退而歡喜不已；此時，警察總督斯卡比亞率領壹群警察前來教堂搜索安傑洛提蹤跡，在查問之下，他確定安傑洛提是在卡伐拉多西的協助之下展開逃亡。在這當兒，托斯卡忽然回到教堂中尋找卡伐拉多西。
斯卡比亞原本就對托斯卡十分愛慕，但卻始終不得美人芳心，此時他見機不可失，於是利用壹把在教堂中找到的女用折扇，挑撥起托斯卡的猜疑和嫉妒心，想藉此透過托斯卡找到卡伐拉多西。托斯卡被斯卡比亞壹番話激怒之後，決心不放過背叛愛情的男友；斯卡比亞見托斯卡中了嫉妒毒藥，想上前安慰，卻被托斯卡拒絕。斯卡比亞隨後安排人員跟監傷心欲絕的托斯卡的行蹤，另壹方面他對自己的壹石二鳥之計逐漸產生效用，暗自竊喜，在教堂的感恩彌撒歌聲中，他不禁得意高呼：“托斯卡，妳讓我忘記了上帝的存在！” 法內斯宮：警察總督斯卡比亞房內
斯卡比亞正在享用晚餐，但是他心裏面卻惦記著越獄政治犯安傑洛提以及***犯卡伐拉多西的下落；同時斯卡比亞還差人遞了壹封短柬給托斯卡，請托斯卡在表演完後抽空來總督府，有要事相告。這時在皇宮外廣場上正為了拿破侖法軍被擊退而舉行盛大的慶祝活動，托斯卡也應邀在活動中演唱。
搜捕結果
史卡比亞助理史波雷塔隨後進來稟報搜捕結果：雖然暫時未發現安傑洛提的蹤跡，但卻逮到了協助逃亡的***犯卡伐拉多西。史卡比亞向卡伐拉多西追問安傑洛提的下落，但卡伐拉多西都以不知情拒答；正巧，托斯卡也匆忙到來，史卡比亞則趁機藉題發揮：他下令收押卡伐拉多西，準備看看托斯卡會有何反應，而卡伐拉多西臨去前還壹再交待托斯卡保持沈默，否則他將命喪黃泉。此時房內只留下史卡比亞和托斯卡二人，史卡比亞假意請托斯卡坐下休息，但卻開門見山地詢問有關安傑洛提藏匿壹事；托斯卡閃躲其詞，而地牢內又傳來卡伐拉多西堅決否認與安傑洛提有關之事，耐不住性子的史卡比亞幹脆告訴托斯卡：她的沈默只會為卡伐拉多西帶來更多的痛苦。最後托斯卡還是忍受不了卡伐拉多西被酷刑折磨的慘叫聲、還有史卡比亞的施壓逼迫，她終於吐露安傑洛提的藏匿地點。
史卡比亞應托斯卡請求，暫時釋放卡伐拉多西。托斯卡眼見愛人片體鱗傷，心痛難忍，而卡伐拉多西則十分在意托斯卡是否保守秘密，此時史卡比亞故意說出安傑洛提的下落，惹得卡伐拉多西大罵托斯卡是叛徒。突然間，壹名史卡比亞的助理沖進來報告拿破侖大軍勝利、意大利潰敗的消息，卡伐拉多西聞言高聲歡呼，並且詛咒史卡比亞的暴政終有滅亡之日。史卡比亞顧不得托斯卡的乞求，再次下令收押卡伐拉多西，托斯卡則提出條件，看看史卡比亞到底要什麽才能交換卡伐拉多西的生命。老謀深算的史卡比亞則說，他雖然貪財，但也不能違背原則，如果要他改變決定的話，這時就必須要有“特別的報酬”，而今晚，托斯卡就是他唯壹的報酬！
托斯卡原本想逃出史卡比亞的玷辱，此時窗外傳來壹陣小鼓聲，這是行刑隊出發前往刑場的信號，史卡比亞告知托斯卡：卡伐拉多西只剩下壹小時的生命，要不要救人，全看托斯卡的決定。托斯卡忍不住暗自悲嘆，她為了藝術、為了愛情，從不傷害他人，甚至還經常暗中幫助貧苦無依之人；她每天也前往教堂祈禱，向聖母獻上珠寶，在夜晚星空下高歌頌贊上天，但為什麽此時老天爺卻給了她這樣的回報？(詠嘆調：為了藝術，為了愛)
逼迫
在史卡比亞的逼迫下，托斯卡雖然悲憤難忍，但為了救出卡伐拉多西，她還是答應了史卡比亞的求歡，而史卡比亞告訴托斯卡，為了圓謊，他必須讓眾人相信：政治犯卡伐拉多西“已經”被處死了。他的方法是以空包彈假裝作戲，讓卡伐拉多西“死而復活”(事實上史卡比亞只是虛應托斯卡，他暗地裏已經下令要以真槍實彈解決掉卡伐拉多西)。托斯卡答應史卡比亞的要求後，她同時也要史卡比亞簽發兩張通行證，好讓她和卡伐拉多西在事後安然逃離。當史卡比亞簽發通行證時，托斯卡瞥見餐桌上有壹把短刀，她拿起刀子，視適當時機準備刺殺史卡比亞。當史卡比亞色瞇瞇地走來、正要擁抱托斯卡時，冷不防地被托斯卡壹刀刺進心臟，托斯卡將壹切怨氣與怒氣此時壹並爆發出來。她對著躺在血泊中掙紮的史卡比亞大喊：“這就是托斯卡之吻！”她壹步步逼進史卡比亞，說她受夠了虐待，而今天這個就是史卡比亞的下場。
當托斯卡從血腥瘋狂中清醒後，她盯著史卡比亞的屍體，若有所思地說：“這個男人終於死了，過去整個羅馬曾在他腳下顫栗不安！”托斯卡清理完身上血跡，從史卡比亞緊握的手中拿走了兩張通行證，臨走前還放了兩只蠟燭在史卡比亞頭部兩側，並且從墻上取下十字架，放在史卡比亞胸前。在壹陣急促鼓聲中，托斯卡匆忙離開總督府。 天使城堡天臺
遠方傳來的牧童歌聲劃過天際，時間已是深夜將盡、黎明來臨之前。卡伐拉多西在警衛隊帶領之下登場，交由壹名獄卒簽收。警衛隊離去後，卡伐拉多西請求獄卒讓他寫壹封信留給心愛的托斯卡，他看著天上繁星，心中壹陣激動與感嘆，不禁回憶起過去與托斯卡相處的美好時光，即使即將面對死亡，他依然熱愛曾經活過的生命！(詠嘆調：今夜星光燦爛)
便衣登場
當卡伐拉多西陷入沈思中，托斯卡隨即便衣登場。她告訴卡伐拉多西如何與史卡比亞達成交易，而在最後壹刻又如何手刃史卡比亞，取得通行證。卡伐拉多西聞言大受感動，於是跪地親吻托斯卡那雙為了救他而飽受折磨的小手。托斯卡趁機告訴卡伐拉多西，待會行刑隊執行槍決時，要他隨槍響應聲倒地，而且是愈逼真愈好；等到眾人散去時，他們就可以壹起遠走高飛、享受自由。
行刑隊
就在小兩口沈浸在即將到來的幸福與喜悅中，行刑隊也陸續來到天臺上，準備對卡伐拉多西執行史卡比亞所“安排”的槍決；在槍響那壹剎那，托斯卡還在壹旁偷偷激賞卡伐拉多西的逼真表演，但是等到行刑隊退場之後、她前去掀開遮蓋卡伐拉多西的鬥篷時，才發現愛人已經氣絕多時。此時史卡比亞的助理史波雷塔發現史卡比亞遭人刺殺，率人前來捉拿托斯卡，托斯卡在無路可去之下，登上城墻，對天高喊：“史卡比亞，上帝面前見吧！”隨即縱身躍下，只留下不知所措的警衛隊士兵。