順治二年（1645年），江陰降清，明朝知縣林之驥解印去職，清知縣方亨繼任，循例頒布剃發令。陰歷六月二十八日鄉耆何茂、邢觳、周順、邢季、楊芳、薛永、楊起、季茂、辛榮等人議請留發。方亨破口大罵。眾人大怒，也罵道：“妳身為中國進士，頭戴紗帽，身穿圓領，來做韃靼知縣，不知道羞恥嗎？”方亨羞愧不已，暫停所議。
閏六月初壹日清晨，方亨以上香為名，召集地方諸生百余人及鄉紳、百姓會於文廟。眾人問道：“現在江陰已盡歸順，應該沒有什麽事了吧？”方亨道：“只剩下剃發了。剛才所差四兵，便為押人剃發之故。”眾人道：“發可以剃嗎？”方亨道：“這是大清律法，不可違背。”說罷就回衙了。諸生許用等人聚集不去，在明倫堂***同立誓道：“頭可斷，發決不可剃！”正在這時，常州府發來嚴令剃發的文書，其中有“留頭不留發，留發不留頭”的話。方亨叫書吏把府文寫成布告張貼，書吏寫到這句話時，義憤填膺，把筆扔到地上說：“就死也罷！”消息很快傳遍全城，立刻鼎沸起來。方亨見士民不從，秘密報告常州府請上司派兵“多殺樹威”。這封密信被義民搜獲，於是在初二日擒住方亨，斬殺清差,推典史陳明遇為首，以“大明中興”為旗號，自稱江陰義民正式反清。
江陰百姓抗清的消息傳開以後，清常州知府宗灝派兵丁三百人趕來鎮壓，閏六月初五日被江陰義民殲滅於秦望山下。其後江陰軍民在陳明遇的帶領下又多次打退小股清軍的進攻。同時嚴查城中奸細，宣布有能檢舉、抓獲奸細的人，賞銀五十兩。處決了私通清朝的原縣令方亨以及眾多出賣情報、有投敵企圖的奸細，有效的遏制了江陰內部的崩潰。
閏六月二十壹，清貝勒、大將博洛命降將劉良佐統重兵包圍江陰城，二十四日，劉良佐作招降書壹紙，從東城外射進。江陰軍民公議後，回書拒絕。劉良佐見勸降無效，便四處捕殺城外義兵，企圖斷絕城內軍民外援。七月初壹日，開始攻城。城中嚴密防禦，清兵箭如雨註，城上的人壹手拿鍋蓋遮蔽，壹手接箭，每天能得到箭三四百枝（壹作三四十萬）。
江陰形勢的日益嚴峻，陳明遇雖忠肝義膽，卻自感缺乏軍事組織才能，於是想起了智勇雙全的前典吏閻應元，想推薦賦閑在家的他代替自己領導守城，因遭到守備顧元泌堅決發對，而不了了之。七月五日的守城戰鬥中，元泌登城射敵，放出的箭每每射不到敵人就墜落在地，眾人有所懷疑。其後，他又命令馬矮子偷竊火藥從城上投給敵人，眾人便把顧元泌捉住，同往他住所搜查，果然找到壹道清兵文書。於是處死了顧元泌及同犯四十人，從而斷絕了清兵的內應。陳明遇原想請閻應元主持擔負守城重任，如今顧元泌被誅，他舊事重提，眾人壹致贊同。陳明遇專門委派十六人連夜出城，到閻應元住所請他出山，應元道：“妳們能從我則可。不然，不為妳們主持。”眾人道：“敢不惟命是聽？”
九日，閻應元帶領江陰城祝塘少年六百人，執械入城，途經七裏廟時，在墻壁上題詩，表達了自己誓死抗爭的決心。入城後，閻應元立即把全城的戶口分別丁壯老幼詳加調查，挑選年輕力壯的男子組成民兵，會合鄉兵二十余萬人分班上城，每個城垛十名，按時換班。由武舉人王公略守東門，汪把總守南門，陳明遇守西門，應元自任守北門。他和陳明遇兼負晝夜巡查四門的責任。對城中過往行人嚴加盤詰，肅清內奸。為了解決軍械糧餉供應，閻應元同紳民商議後，委任擅長理財人士負責把城內公私所藏物資分類征集，統壹分配使用。在閻應元的領導下，很快就做到了人盡其才，物盡其用，各方面的工作做得井井有條。
十壹日，清兵攻打閻應元鎮守的北門，城上矢石如雨註，清兵不敢接近。主帥劉良佐大怒，命令上將九員先駕雲梯上城，城上以長槍刺之，上將五死四傷，有的身中三箭，有的被劈去頭顱，有的墮下摔成齏紛，有的被火箭燒死。主帥更怒，傳令十營內選猛將幾員，步軍三萬，紮雲梯十張，來日分十處上城，如有退者立斬。次日，清兵仍攻北門，城外放炮吶喊，三萬軍造浮橋十條，壹齊渡過外城河，分十處登雲梯上城。閻應元指揮城上用磚石擲下，以長槍拒敵；壹時間亂石紛飛，炮火連綿，雙方死亡不計其數。某滿人大將自恃勇猛，穿著三層甲，腰懸兩把刀，背背兩把刀，手執雙把刀，親登雲梯，跨上城垛，執刀亂砍。城上守軍用棺木抵擋，以槍刺其身，竟不能入。有人喊道：“刺他的臉。”於是眾人紛紛刺其面，壹湯姓童子，持鐵鉤鐮，用力鉤斷其喉管，竹匠姚邇割下他的頭，滿將身子墮落城下。清兵齊來搶屍，城上梆鼓齊鳴，磚石小箭如雨點，清兵又傷亡千余人。
劉良佐命令軍士索那滿將的頭，閻應元不允。劉良佐願意用銀贖買，命人將銀當面裝入銀鞘吊入城。又命軍士於城下哀號：“還我將軍的頭！”閻應元讓人以蒲包裹壹黃狗頭，擲還之，將滿將的頭懸在城上。劉良佐親自帶人在城下苦苦哀求，方把頭扔下。清兵拿了頭回去，與身縫合，掛孝三日。閻應元擊退了北城的攻擊，但知道不日清兵必有更大規模的攻擊。於是積極鑄造守城工具，招青陽弩王黃鳴崗等千余人，入城造小弩千張、小箭數萬枝，分派給守城軍士。又用季從孝所合火藥敷在箭頭上射人，見血立死。弩長尺余，箭長五寸，百步之外，皆可命中目標。又從獄中放出陳瑞之子，令他制造火磚、木銃。火磚廣三四寸許，著人即燒，木銃類銀鞘，長三尺五寸、廣二三寸，木制，中間藏有火藥，敵人到來時，投下，機關暴發木殼崩裂，鐵菱角飛出，觸人即死。閻應元還親自制造撾弩，用壹塊鐵，邊上造幾個鉤子，後面栓著棉繩，拋出勾住敵人，近前斬之。又模仿舊制，制造火球、火箭之類，無不精巧絕妙。所以清兵雖多，每每望城興嘆，戰栗無人色。即使是滿洲兵將也聞之膽落，每次攻城下來都要為幸免不死而大肆慶祝。
清兵攻城不利，又起勸降之念。劉良佐親作《勸民歌》，希望江陰投降，閻應元不從。於是清兵在城下搭建牛皮帳篷，做好長期作戰的準備。十五日，清兵攻東北城，劉良佐命西南放炮，東北掘城，皆用山爬攻城，城內以火球、火箭抵抗。清兵不敵欲退，良佐嚴令方止。閻應元繼續命城內投下磚石，清兵不及閃避，數百人死於城下。良佐慚愧、惶恐。於是搭設三層牛皮帳，守而不攻。帳內有九梁八柱，矢石投在上面，都被反彈起來，不能進入。閻應元下令用人糞，摻上桐油，煎滾澆下，牛皮燙穿，澆在清兵身上，肉爛而死。沒被燒著的清兵驚惶散去，城內用撾弩射向逃散的清兵，鉤中者，即入城中裊首。清兵手足無措，紛紛逃散。敵營以為守城者殺下，命令發射木銃以禦，反傷自己的馬步卒無數。無奈之下，劉良佐命令移營至鄧墓。
在堅守的同時，江陰向四方請求援助，黃蜚、吳之葵領兵至太湖，與清貝勒博洛大軍相遇，二人兵敗被俘後，投降清朝。海寇顧三麻子因敬慕閻應元的為人，率舟師來援，苦戰三日後失敗，揚帆遠去。此外，義陽王來援，敗於砂山；秀才金礦會集精勇四百余人來援，被劉良佐以鐵騎三千截在周莊左右，全軍俱沒。外兵屢敗，江陰淪為孤城。即便如此，劉良佐心有余悸，不敢再攻城，只用火炮攻擊北城，徹夜不息，城垛在炮火的轟擊下塌陷數丈。閻應元命石匠砌墻，匠危懼不前，閻應元言辭懇切，動之以情，石匠深受感動，於是冒死登城修葺城垛，使之牢固如初。
十四日，閻應元利用清軍勸降之機，派出百余名壯士，以奉送“降禮”為名,暗攜火器進入清軍營帳,炸死清軍官兵兩千余人。十七日夜，閻應元挑選勇士千人出南門劫營，或執板斧，或執短刀，或用扁擔，突入敵營，傷千余人。及他營來救，應元兵已返回城中。此役之後，劉良佐再次後撤，紮營在十方庵。
十八日，劉良佐令十方庵的僧侶向城跪泣，陳說利害，勸江陰軍民早降。城中皆願以死報國，要他速去。當晚，僧人又來勸降，再次被眾人遣走。十九日，劉良佐策馬來到城下，勸應元道：“宏光已北，江南皆下。若足下轉禍為福，爵位豈在良佐下，何自苦如此？”閻應元從容道：“江陰士民，三百年來食毛踐土，深戴國恩，不忍望風降附。應元是大明典史，深知大義所在，絕不服事二君。將軍位為侯伯，掌握重兵，進不能恢復中原，退不能保障江左，有何面目見我江東忠義士民乎？”良佐慚愧不已，又以清廷召諭相示，勸江陰士民接受招安。應元怒道：“有降將軍，無降典史。”壹聲梆響，火箭齊發，良佐連跨三四馬逸去，嘆息道：“江陰人沒救了！”
清朝親王多鐸聞知江陰久攻不下，極為震怒，他先派恭順王孔有德“率所部兵協攻”，接著又派貝勒博洛和貝勒尼堪帶領滿洲兵攜紅衣大炮前往攻城。貝勒博洛平定松江後，統率所部二十萬大軍來到江陰城下，他認為劉良佐曾任明朝伯爵，手握重兵，卻連壹個江陰縣城也攻不下來，無能至極，於是打了他壹頓板子。他登山而望，巡視江陰城防後，對手下講：“此城舟形也，南首北尾，若攻南北，必不破。惟攻其中，則破矣。”他命人綁縛降將黃蜚、吳之葵到城下，命令他們做書勸降，黃蜚道：“我在城中沒有相識，寫了勸降書又有何用？”吳之葵涕淚交橫，仰頭勸閻應元投降，情詞悲楚，應元叱道：“大臣被縛，當速就死，何必喋喋不休！”之葵再拜泣下，蜚默默無語。
博洛見閻應元義不可動，發起總攻，分兵先抄斷各鎮救兵，以竹籠盛火炮，鼓吹前迎，炮手披紅掛彩，限三日破城，二十日至二十七日，清兵輪番攻城不息，閻應元指揮防禦，浴血奮戰，終保江陰城池不失。
八月初，江陰民兵晝夜守禦，甚感疲憊。開始有人出城投降。清兵在城外四處殺掠，民不聊生，為江陰百姓不齒，那些剃發投降的人，被城上看見，必然痛罵，即使是至親也像仇敵壹般。閻應元見城防吃緊，遍取民間亂發，投城下誘敵。清兵驚喜，報告劉良佐。良佐道：“還不能相信，去觀察壹下守城的人剃發了嗎？”清兵察探後，方知是詐降。
博洛久攻不下，心中焦急，於是重新勸降，稱只要拔去大明中興的旗號，四門懸掛大清旗號四面，只殺斬首事者數人，其余壹概不論，即使不剃發，也會撤兵。閻應元看出博洛的緩兵之計，遂道：“只斬我壹人？我沒有罪，憑什麽殺我！”議不決而止。博洛又稱只要在四城豎起大清旗四面，也會立刻退兵。閻應元情知有詐，仍不應。前吳軍門督軍王海防至江上，宰牛殺羊與諸將起誓，稱江陰歸順後絕對不許殺掠。他自恃在江陰素有恩信，請纓來勸降，但臨城招撫，卻無人應和。此後攝政王多爾袞曉諭招安，博洛命人用箭射入城中，言明已亡，何苦死守？閻應元命人在書後補上：“願受炮打，寧死不降！”射還給清兵。清廷多次勸降，三城已經開始有人猶豫，但因閻應元鎮守的北門誓死固守，眾意遂絕。
被困既久，江陰城內傷亡慘重，戰鬥力日減，城中石灰斷缺，不能乘夜修城。飯米越來越少，只能靠征集民間的米以備缺乏，閻應元下令兩日領壹次米，不得預先領取。中秋前後，百姓攜壺提觴登上城樓，舉杯痛飲，諸生許用模仿楚歌，作《五更轉曲》，讓善歌的人登高傳唱，以笙笛簫鼓相和。當時天無纖翳，皓月當空，清露薄野，劍戟無聲，黃弩、師鼓、胡琴於西城之敵樓，歌聲悲壯，響徹雲霄。清兵爭著靠前傾聽。或怒罵，或悲嘆，甚有泣下者。歌中唱道：“宜興人，壹把槍。無錫人，團團壹股香。靖江人，連忙跪在沙灘上。常州人，獻了女兒又獻娘。江陰人，打仗八十余日，寧死不投降。”還有許多歌曲，但意思大致如此。劉良佐針鋒相對，命人作勸降詞，讓士卒相倚而歌，自己與幕僚在帳中飲酒，不壹會兒，城上炮、箭齊發，遂散去。
二十壹日，博洛令數百人，把二百余座大炮全部搬到花家壩，專打東北城。鐵子入城，穿透洞門十三重，樹亦穿過數重，落地深數尺。當日雨勢甚急，外用牛皮帳護炮裝藥，城頭危如壘卵。城上因敵炮猛烈，見燃火，即躲到圍墻後面。炮聲過後，再登上城樓。清兵看到這種情況，故意放空炮，並讓炮中只放狼煙，煙漫障天，咫尺莫辨。守城者只聽炮聲霹靂，認為清兵不能很快進入，而不知清兵已潛渡城河，從煙霧中蜂擁突上，眾人來不及防禦而崩潰。江陰終於被攻陷了。當清兵上城時，壹隊民兵對城列陣。清兵怕有埋伏，僵持半日不敢進攻。到黃昏時，城中鼎沸，民兵陣腳散亂，清兵才敢下城。
城破之時，閻應元端坐於東城敵樓之上，要了壹支筆，在城門上提到：“八十日帶發效忠，表太祖十七朝人物，十萬人同心死義，留大明三百裏江山。”題訖，帶著千人上馬格鬥，殺死清兵無數，欲從西門突圍而不得。他環顧從者道：“為我謝百姓，吾報國事畢矣！”自拔短刀，刺胸血出，投在前湖中。義民陸正先想把他從水中扯起，正趕上劉良佐遣兵來擒，良佐自稱與閻應元有舊，要生擒他，於是清兵把他撈起綁住，沒有殺他。良佐踞坐在明佛殿，見應元來了，躍起，兩手拍應元背而哭。應元道：“有什麽好哭的，事已至此，只有壹死。速殺我！”博洛坐在縣署，急索應元至堂上。閻應元挺立不屈，背向貝勒，罵不絕口。壹卒以槍刺他的小腿，閻應元血流如註，不支倒地。博洛命人把他關到棲霞庵。當夜，寺中僧人不停聽到“速殺我”的聲音，天明時，終遇害。
閻應元死後，家丁猶存十余人，皆因不降而被殺，陸正先也壹同殉難。典吏陳明遇命令關閉縣衙，舉火焚死男女大小***四十三人，自己持刀與清兵血戰，身負重創，握刀僵立，死時，身子倚在墻邊，屹立不倒。訓導馮厚敦自縊於明倫堂，妻與姊投井死。中書戚勛、諸生許用舉家自焚而死。八月二十二日，清兵開始屠城，百姓或力戰到底，或坦然就義，都以先死為幸，沒有壹人順從。清軍屠城兩日後“出榜安民”，城內百姓僅剩“大小五十三人”而已。
據《江陰城守後紀》所述：閻應元軀幹豐碩，雙眉卓豎，目細而長曲，面赤有須。每次巡城，身邊有壹人執大刀跟隨左右，頗有雲長再生之感。清兵望見，以為天神。閻應元號令嚴肅，對茍且偷安、不守法紀的人，必然重加責罰，以警示眾人，即使時鄉紳、豪強也不例外。而當戰士困苦時，他又會親自熬藥斟酒，溫言慰勞；當有人遇難，他親自購置棺木，哭奠而殮葬；接見敢死隊的戰士時，不稱姓名而稱兄弟。遇到重要的任務，必然詢問眾人：“我兄弟誰能完成此事？”有人當路大喊道：“我欲殺敵，苦無短刀。”閻應元馬上解下身上所佩價值二三十金的短刀，為其帶上。閻應元凡事以身作則，誠懇待人，所以士、民都懷德畏威，瀕死不悔。