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植物組織培養中如何防止汙染

防止汙染的主要措施是:

(1)改善環境條件。接種室和培養室應定期消毒凈化,接種前工作臺或接種箱應開啟30min以上。培養室的相對濕度應控制在70%左右。相對濕度過高時,可用除濕機除濕。

(2)接種人員的培訓非常重要,應嚴格執行無菌操作。接種所需工具在使用前必須嚴格消毒。在潔凈工作臺的操作區,不要放太多要用的材料,以免氣流受阻。還要定期檢查潔凈工作臺的工作質量[8]。

(3)嚴格檢查接種材料。消除被真菌和細菌汙染的接種材料。

(4)經常檢查滅菌器的滅菌質量,發現問題立即修復。消毒鍋的壓力表降到零後不能馬上拿出來。由於冷熱空氣作用產生的負壓效應,使外界環境中的冷空氣被吸回已滅菌的培養瓶中,造成真菌汙染。為避免這種現象,應在鍋稍微冷卻後,將滅菌後的培養瓶從鍋內取出[9]。

(5)檢查培養容器是否有問題。培養容器通常用塑料蓋、橡皮塞、棉塞、薄膜等密封。塑料蓋用久了容易老化,密封性差,也會造成汙染。林升等人配制了壹種“4號消毒液”對瓶口進行消毒,可將培養基汙染率控制在0.3%以下[10]。

傳代培養中汙染的預防和控制

初期獲得的無菌材料理論上是無菌的,但在後期或繼代培養中也會被汙染,除了操作不慎,還可能被培養室內蟎蟲傳播的真菌汙染。這種汙染可以從兩個方面來預防:(1)擴大再生產要有合理的程序。在獲得原始無菌培養產品後,其中壹部分要作為“原種”保存,然後進行批量繁殖和復檢,再提供批量生產。(2)可以在培養基中加入抗菌劑來防止[3]。徐萬芳等人在金線蓮組織培養中使用多菌靈抑菌促生,效果明顯優於甲霜靈、甲基硫菌靈及其混合物。生長在含多菌靈培養基中的金線蓮未被微生物汙染,殺菌率為100%,無白化苗,苗健壯[11]。

植物內生細菌具有很深的潛力,不能通過表面消毒來消除。有時,在外植體的初始培養中,包括前幾代的繼代培養中,在培養基上不容易被肉眼檢測到。隨著繼代次數的增加,細菌量逐漸積累發展,然後出現在培養基上[12]。黃小容等人認為植物組織培養中細菌汙染的原因是休眠細菌孢子萌發的結果[13]。通過在培養基中添加抗生素、培養莖尖和降低PH值,可以預防和減少細菌等內生細菌的汙染。

王壹菲等在彩色芋頭快繁至第4-5代時添加200mg/L青黴素GK,可有效抑制內生菌的生長,而不影響繁殖系數[14]。在長春藤的組織培養中,翟建忠等人用鏈黴素抑制內生細菌黃單胞菌。其效果優於慶大黴素和頭孢唑林鈉。在培養基中同時使用這兩種抗生素有利於防止細菌產生耐藥性,長期控制細菌汙染的發展。然而,鏈黴素劑量的增加會對植物產生毒性[15]。

在培養基中添加抗菌劑時,選擇合適的濃度非常重要。低濃度會效果差,高濃度容易毒害植株,影響增殖或使培養的材料變黑,造成死苗和白化苗。兩種或兩種以上抗生素聯合使用,可預防和控制細菌的耐藥性。抗生素和多菌靈壹般不耐高溫,需要過濾滅菌,生產中不方便添加。苯甲酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈉是食品中常用的防腐劑,耐高溫高壓,便於在組織培養生產中使用。

植物材料中的內生菌也可以通過重復莖尖培養來去除。由於病原菌在植物體內的分布是不均勻的,莖尖分生組織通過維管束傳遞是無菌的,通過反復莖尖培養,無論是內生細菌還是病毒都可以被去除。

除歐文氏菌外,大多數細菌在培養基PH小於4.5時不能生長。在紫苑、鳶尾、薔薇的組織培養中,將培養基的PH值從5.8調整到3.9 ~ 4.3,可以防止大量的細菌汙染[7]。胡青等在低PH值(3.10)的水中培養,並改善容器的通風條件,可使細菌汙染嚴重的綠巨人塊正常增殖,對單株生長無害。生根苗比例高於常規固體培養,基本解決了細菌汙染嚴重後的產菌問題[16]。

對於被汙染的培養物,有時會因為植物材料的稀少或反復出現而耗費大量時間,較大的植株也可以切割消毒後再次接種。李等分別用400萬或600萬單位/L青黴素無菌水溶液浸泡銀白楊組織培養中的細菌汙染苗60min或40min,可有效防止組織培養中的細菌汙染。處理後的幼苗繼代培養時,沒有反復的細菌汙染,幼苗分化能力強。生根時根系發達,移栽成活率高[17]。Mars等人證明,如果繼代培養中只有真菌汙染,可在3%多菌靈無菌溶液中浸泡0.5h以上,用無菌水沖洗後接種或不經無菌水沖洗直接接種即可消除真菌汙染。如果細菌和細菌、真菌同時汙染,可以用HgCl2消毒法重新建立無菌育苗體系,將汙染的幼苗切成長莖段作為外植體,用自來水沖洗0.5h,然後在超凈工作臺上用乙醇和HgCl2短時間處理[18]。

4.減少培養基中的有機成分

培養基中有機物的存在是造成汙染的重要原因,去除有機物也是減少汙染的壹種方法。在阿月渾子的組織培養中,宋鳳輝等人去除了有機成分(如VB1、VB6、煙酸等。)在培養基中,經2 ~ 3代培養後,能抑制細菌的生長,對叢生芽的生長和增殖無影響。原因是這些都是某些細菌生長的必要物質。去除這些有機物後,細菌無法生長發育,死亡逐漸減少[19]。日本Toyuki Kozai教授首創的植物無糖組培快繁技術,完全去除培養基中的有機成分,輸入可控量的CO2氣體作為碳源,通過控制環境因子促進植物的光合作用速率,使植物由異養轉化為自養,使植物生長良好,汙染率明顯降低[20]。由於去除了糖分,組培苗的培養由玻璃瓶變成了箱式容器,整個培養室也可以作為培養容器,甚至不需要嚴格的無菌操作,汙染也很小。這項技術至少在很多植物組培苗的生根促進階段是非常成功的。

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