近年來，隨著惡性腫瘤的高發、艾滋病的流行、化療藥物、廣譜抗生素、糖皮質激素和免疫抑制劑的廣泛使用，以及人工導管、器官移植等有創診療技術的應用，真菌引起的感染日益成為臨床科室面臨的巨大挑戰。
為了提高臨床診斷水平，加強真菌檢驗能力非常重要。現將臨床微生物實驗室真菌檢驗的常見問題總結如下，供大家參考。
1.為什麽要把培養設定在35℃呢？
為了防止溫度波動對細菌或真菌生長的影響，實驗室通常將培養箱溫度設定為35℃。臨床常見細菌的最適生長溫度為33~37℃(嗜熱菌和中溫菌除外，占少數)。設定在35℃時，不會因為波動2℃而影響培養。如果設置在37℃的話，顯然是不合適的。至於真菌培養，要看標本來源。
對疑似淺部真菌感染的皮屑、指甲屑、頭皮屑和頭發等標本進行分離培養，培養溫度為26~28℃。來自人體深部組織的標本，如痰液、胸腔積液、血液、骨髓深部膿腫等，建議在更接近人體體溫的35℃培養。其次，最常見的臨床白色念珠菌在35℃下可形成較為典型的假鬼臼菌落，與35℃血清發芽試驗相同。
同時，在35℃下分離的光滑假絲酵母具有較高的酶活。懷疑溫度型雙相真菌感染或單個真菌需要在較高溫度下生長，兩種溫度需要同時培養。還要註意培養環境的濕度，壹般要求大於60%。如果培養箱的濕度不夠，最好在平板附近放置裝有無菌水的容器，以保證濕度。
2.CO2對真菌的生長影響大嗎？
真菌屬於異養微生物，主要從有機物中獲取碳源，而自養微生物只需要從CO2中獲取碳源，所以真菌壹般不需要在二氧化碳環境中培養，CO2不利於真菌的生長繁殖，但壹定濃度可以刺激孢子形成。
3.血培養兩次培養出真菌，但患兒無臨床表現，臨床未使用抗真菌藥物，患兒情況良好。汙染是個問題嗎？
這種情況下需要判斷是否是汙染菌，調查采血流程是否規範，血瓶轉移流程是否符合要求，針孔是否密封良好，轉移盒是否被汙染等諸多因素。最重要的是患者的臨床表現。如果沒有真菌感染的癥狀，應該考慮汙染或定植(不太可能)。
4.在我們基層醫院的實際工作中，陰道分泌物真菌培養幾乎無法進行生化鑒定，很多人直接報告白色念珠菌。這樣合適嗎？
這是不合適的。現在有的檢驗科連酵母菌和黴菌都分不清，在顯微鏡下發現陰道分泌物、尿液、糞便中有念珠菌後就報告為“發現黴菌”。
黴菌是指絲狀多細胞真菌；酵母指的是單細胞真菌，兩者不能混為壹談。陰道內感染的酵母菌多為白色念珠菌，但也不排除其他酵母菌。
藏紅花念珠菌對氟康唑和5-氟胞嘧啶有天然耐藥性。如果遇到自然耐藥的類似菌株，會影響後續治療。
5.痰標本中有少量念珠菌需要在報告中反映嗎？還不舉報？
標本要求和檢查程序要有所體現，臨床醫生會綜合考慮。雖然白色念珠菌引起肺部真菌感染的概率很小，但建議臨床醫生結合影像學結果報告和考慮該真菌。
晚期痰標本要直接塗片。如果標本質量合格，如果在痰培養中見到真菌絲、假菌絲或大量孢子、真菌生長，應向臨床醫生報告，由臨床醫生綜合考慮。至於要不要做藥敏，可以和醫生溝通後再決定。
①留樣前建議用5%蘇打水漱口；
②早晨第壹次痰；
③發送3d圖像的結果是否壹致。
最好能和臨床醫生交流，或者平時對醫生護士進行標本采集方法的培訓。報告前，結合痰塗片鏡檢結果，註意標本的質量信息和汙染的可能性。
6.請問:前幾天偶然發現壹個提取的膿液標本，血培養抓到的。陽性報告後，塗片顯示真菌孢子。轉移後塗片呈圓形，墨汁染色陽性，但無包膜。轉完之後的柯瑪佳已經沒有顏色了，白的有點黃。這表明它幾乎是光滑的和藥物敏感的。問題是:①這個結果可信嗎？②墨水是不是普通果汁有關系嗎？③如何提高？
墨汁染色是對標本中隱球菌特別是新生隱球菌的莢膜進行的陰性染色試驗，不能作為純培養隱球菌的鑒別試驗。
(1)對之前的膿液標本做10%KOH濕活檢，尋找真菌孢子和真假菌絲。
(2)培養結果要可信，最好與臨床醫生溝通，看患者是否有癥狀。
(3)對某國產品牌不熟悉，鑒定結果和藥敏結果難以判斷。
(4)按照國家操作規程，準備了鑒定念珠菌的生化管，原衛生部控制的真菌鑒定符合率還是很好的。可以考慮自己做生化管，用質控菌做驗證。
(5)用每個批號驗證壹個國產鑒定管的質控菌，如果結果壹致，應該沒有問題。
(6)最好參加原衛生部的微生物質控培訓，這有助於妳提高業務水平，驗證妳所用試劑的質量，無論細菌還是酵母。
(7)只要油墨粗細均勻，顆粒越細越好。推薦曹素功墨水，印度墨水可以到試劑公司購買。
7.在常見的臨床痰標本中首次檢出曲黴菌後，該過程是如何進行的？
(1)首次從痰標本中培養出絲狀真菌菌落，前提是痰標本新鮮或不能立即送檢，應保存在4℃冰箱中。
流程是痰標本驗收→鏡檢→培養→鑒定。
痰標本合格後，先做10%KOH濕膜鏡檢，低倍鏡下尋找真菌菌絲，是否透明或深色，是否有45度分支。
如果痰標本合格，發現菌絲，電話聯系門診，告訴醫生有絲狀真菌生長，懷疑是XXXX。直接向臨床報告容易，種植夏克瓊脂平板或查茲瓊脂平板，然後進行進展鑒定就難了。
(2)如果標本不合格或合格，但標本中未發現菌絲，與臨床醫生電話溝通，告知有真菌生長，以便醫生綜合考慮。鑒定正常進行，診所上報。這番話不排除汙染的可能。
8.酵母同化試驗為什麽把28℃而不是35C？同化試驗和發酵試驗有什麽區別？為什麽教科書上說任何能發酵某種糖的人都必須同化它，而同化某種糖卻不壹定能發酵？
大多數酵母的體外最適生長溫度為28-30℃，因此選擇該溫度進行體外實驗。轉化和發酵分別指真菌的有氧呼吸和無氧糖酵解。前者將糖分解成二氧化碳和水，後者將糖分解成二氧化碳和酒精。
它的代謝首先是有氧呼吸獲得能量，然後是無氧糖酵解，這是由細菌和真菌的相關酶決定的。大多數酵母是專性需氧細菌，因此實驗設計主要基於糖同化試驗。比如隱球菌只能有氧呼吸，所以只能同化葡萄糖不能發酵，而釀酒酵母可以把糧食發酵成酒，既發酵又同化葡萄糖。
9.針對目前真菌培養不是很規範的情況，如何選擇培養基、溫度、報告時間和方法？請描述壹下實驗室的具體流程。
(1)培養基:謝赫氏葡萄糖瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、腦心提取物瓊脂等適合真菌生長的培養基。臨床上懷疑是酵母菌和酵母樣細菌感染。如果條件允許，實驗室可以平行接種顯色培養基。推薦采用螺旋管斜面培養法，標本經處理後接種於培養基斜面的中下部。對於大多數需氧菌，建議平行接種兩管。
(2)培養條件和報告時間:深層真菌應在28±65438±0℃培養7 ~ 65438±04d。如懷疑雙相真菌感染，應在65438±0℃同時進行28℃和35℃培養。
若懷疑罕見真菌感染生長緩慢的真菌或已使用臨床抗真菌藥物，觀察時間應延長至少4周。
例如，腦脊液應在28℃和35℃培養至少壹周；
痰/尿/糞壹般可35℃48h。如果沒有絲狀真菌生長，培養時間會延長。
組織標本通常在30℃保存2~4周。
10.科馬佳顯色培養基可以作為真菌的原代培養基嗎？
作為原代培養基之壹，建議接種沙氏培養基或酵母氮培養基(YPDA)。SDA和YPDA通常是酵母樣細菌的標準培養基。
11.咽拭子培養真菌有意義嗎？
用咽拭子培養真菌意義不大，除非患者有臨床表現，否則存在定植。
12，想問壹下痰標本念珠菌定植率這麽高，痰塗片中孢子和假菌絲多怎麽報？
個人認為還是要如實向臨床醫生匯報，告知臨床醫生標本質量是否合格。至於是否感染，臨床醫生會根據影像學資料和患者的臨床表現綜合考慮。
13.患者手上出現濕疹樣丘疹，疑似真菌感染。我如何能取樣？
對於皮損的采集，需要先用70%的酒精對患處進行消毒，然後用已消毒的不銹鋼刮刀或手術刀刮去皮損邊緣的皮屑，放入無菌容器中進行檢查。
14，SDA片可以用壹次性手套嗎？
壹次性手套，無論是PV還是乳膠，都會產生相對低氧的環境，而真菌是好氧菌，會影響真菌的生長。不建議執行此操作。
可以用透氣膠帶(靜脈輸液固定針頭用)把平板封好，註意不要封的太緊。
15，用的墨水在顯微鏡下不是均勻的黑色背景，而是壹些黑色小顆粒。這是墨水質量差嗎？還有，生物安全櫃、潔凈工作臺櫃、通風櫃有什麽區別？
墨水本身是在溶劑中加入壹些微小的顆粒而形成的，墨水的質量在於顆粒的大小和均勻性。
壹般墨水檢測隱球菌時應該可以觀察到，它只是作為背景，膠囊是不染色的，透明的，而背景是黑色的。
生物安全櫃和潔凈工作臺的區別在於風吹的方向:
生物安全櫃的風向先垂直向下，再進入櫃內，經HEPA過濾循環後排出，在櫃內形成壹個相對負壓的環境；
潔凈工作臺的風向是先向下再向外吹，以保證櫃內的清潔無塵，通常用於配置平板，操作壹些簡單的分子克隆相關實驗。
通風櫃通過風機將櫃內空氣排到實驗室外，風機通常用於配置揮發性化學試劑，將有害氣體排到室外。
16.痰塗片中看到曲黴菌頭有什麽臨床意義？有沒有被毛黴汙染的可能？還是固定值？痰中檢出了青黴菌，是不是沒有意義？
如果直接鏡檢痰標本發現曲黴菌頭，應考慮曲黴菌感染。培養可以確定是哪種曲黴菌。
毛黴有汙染的可能，也可以存在於空氣中。但由於其侵入性較高，報告需謹慎，設定定值的可能性很小，但操作中仍有很多汙染的案例。如果標本合格，且濕膜鏡檢有90度分支和粗大、不分裂的菌絲，應考慮，否則有汙染的可能，最好及時聯系臨床醫生。
青黴菌是壹種條件致病真菌。如果顯微鏡直接在痰中檢測到菌絲，培養陽性，應考慮感染。
17.在經驗積累的初級階段，如何獲得足夠的菌種來練習各種染色和讀片？
有條件的話，最好去相關醫院的真菌室做進壹步的濕鏡檢查和真菌鑒定。將保存的菌種分批轉移後，仔細研究菌落顏色、大小、質地和鏡檢的變化，並做好記錄。或者參加醫學真菌專業培訓班進行系統學習。
18，真菌菌種如何保存？
最好的方法是真空幹燥和低溫冷凍。這種方法被國際菌種保藏機構所采用。
(1)將生長斜面直接冷凍在-10℃，不適合皮膚癬菌和許多接合菌菌種的保存。
(2)蒸餾水保存法:將生長在馬鈴薯葡萄糖培養基上的成熟菌落的菌絲體、孢子或酵母細胞刮下或用無菌蒸餾水沖洗斜面，然後用吸管吸出並置於無菌小管中，密封防止蒸發，室溫保存。
(3)另壹種方法是在黴菌生長的瓊脂斜面上直接加入無菌礦物油，至少可以保存半年。
(4)在基礎液體培養基中加入15%~30%甘油，挑取新鮮成熟菌落，於-80℃保存。
19，是否是真菌感染我們會重點關註什麽樣的患者？
免疫缺陷患者、器官移植患者、腫瘤患者、中性粒細胞減少患者以及長期使用廣譜抗生素的患者。
20.黴菌培養箱(28C)被汙染後怎麽辦？汙染的細菌在培養基放入培養箱後生長很快，特別是在門上的密封條上。我該怎麽辦？
停電後甲醛熏蒸，用5%苯酚(石炭酸)擦拭30分鐘，清水擦拭，開通風24小時後使用。
21.血培養可能培養出什麽絲狀真菌？什麽是汙染？
血培養陽性的絲狀真菌主要有組織胞漿菌、馬爾尼菲藍細菌、鐮孢菌屬、念珠菌屬、隱球菌屬、毛孢子菌屬和賽多孢菌屬。在人眼球組織中培養紫色擬青黴(磨碎並放入血培養瓶中)。將腹水泵入血培養瓶中培養布朗腐黴。
文獻報道皮炎芽生菌、Aemon和球蟲病都可以從血培養中培養出來。
煙曲黴被汙染，有報道從心內膜炎患者外周血培養出土曲黴[I Clin microbiol . 1998 nov；36(11):3347-51]。
22.呼吸道患者1例，男，61歲，診斷為支氣管肺炎，HIⅳ陰性，合格痰培養出藍細菌馬爾尼菲3+。能確診嗎？有必要復檢嗎？
他肝脾大嗎？有沒有骨骼受累？皮膚受累還有？還是僅僅局限在肺部？病人有其他潛在疾病嗎？
建議標本再送壹次，如果藍藍馬爾尼菲反復培養妳要警惕。痰中培養出馬爾尼菲青黴菌，應考慮為致病真菌。
藍細菌馬爾尼菲和曲黴菌的區別；
如果在直接臨床標本(體內)中，藍細菌馬爾尼菲是壹種酵母樣孢子，而曲黴菌是壹種分枝呈45度角分開的菌絲體。
如藍細菌馬爾尼菲在體外28℃培養可呈淡黃色、黃綠色，背部紅色，紅色色素滲透培養基；
曲黴菌壹開始是白色的，表面可以是不同顏色的顆粒，以此來區分哪個是曲黴菌。
藍木耳馬爾尼菲能看到掃帚枝，曲黴菌能看到曲黴菌的頭。
以上內容來源:盧洪洲、錢學勤、徐和平主編的《藥用真菌檢查與圖解》。
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